O presente estudo investigou a presença de Ehrlichia spp. em cavalos e carrapatos de propriedades rurais localizadas nos municípios de Poxoréu, Poconé e em ranchos em Cuiabá, situados no estado de Mato Grosso, e em um rancho no município de Corumbá, localizado em Mato Grosso do Sul, por meio da detecção molecular, sorológica e dos fatores de risco associados à infecção. Foram avaliados 148 equídeos no Mato Grosso e 12 equinos no Mato Grosso do Sul. Coletaram-se sangue e carrapatos dos animais, os quais foram avaliados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar fragmentos parciais do gene dsb e 16S rRNA erliquial. Soros equinos também foram avaliados por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para detecção de anticorpos anti-Ehrlichia spp. Possíveis associações clínicas e hematológicas foram avaliadas junto aos resultados de PCR e RIFI para Qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Das amostras do Mato Grosso, 3 equinos (2,03%) apresentaram fragmentos do gene dsb e 61 equídeos
(41,2%) reagiram na RIFI com títulos variando entre 40 e 2560. A sororreatividade a antígenos de E. canis foi associada a parasitismo de carrapatos, origem rural, hipoalbuminemia e hiperproteinemia (p ≤ 0,05). O total de 901 espécimes de carrapatos que foram retirados desses animais e identificados como D. nitens, A. sculptum e R. microplus foram negativos na PCR. Das amostras provenientes do estado do Mato Grosso do Sul, os DNA extraídos do sangue dos equinos não apresentaram amplificação nas PCR, e cinco deles foram sororreagentes na RIFI (41,7%), com títulos variando de 40 a 160. O total de 57 espécimes de carrapatos que foram retirados desses animais e identificados como D. nitens, A. sculptum e R. microplus, destes uma fêmea adulta de A. sculptum, amplificou fragmentos dos genes dsb e 16S rRNA para Ehrlichia. Foram identificadas pela primeira vez evidências da infecção natural de Ehrlichia minasensis em equinos do estado de Mato Grosso e uma cepa de Ehrlichia sp. em carrapato Amblyomma sculptum proveniente do Pantanal sul-mato-grossense, apresentando similaridade com as cepas detectadas em mamíferos selvagens no Brasil e na Argentina.
Dissertações/Teses
Influência do tempo de armazenamento nas concentrações de metaloprotease-1 e ácido hialurônico em membrana amniótica canina e seus efeitos sobre os resultados clínicos em ceratites ulcerativas complicadas de cães.
Objetivou-se determinar a concentração do inibidor tecidual de metaloprotease-1 TIMP-1) e do ácido hialurônico (AH) em membranas amnióticas (MAs) caninas criopreservadas por diferentes períodos. Os resultados de defeitos corneais de cães reparados com MAs armazenadas por diferentes períodos também foram avaliados. Dez MAs foram utilizadas em meio modificado de Dulbecco e glicerina (1:1) a −80°C. As MAs foram criopreservadas por curto (estocadas por 2-50 dias), médio (92-210 dias), ou longo prazo (256-357 dias). A TIMP-1, e o AH foram quantificados por ELISA. Registros de 21 olhos de cães submetidos ao transplante de MA para reparar perfurações ou ulcerações corneais foram revisados. Os dados obtidos entre as avaliações das MAs das doadoras e os resultados clínicos foram comparados estatíticamente entre os períodos. Possíveis correlações entre os tempos de estocagem e com os resultados obtidos nos olhos reparados com MAs de diferentes períodos também foram avaliados (P<0,05). Os níveis do TIMP-1 foram maiores comparando-se, MAs estocadas a curto prazo com as de médio (p=0,02) e a longo prazo (p=0,0009). As concentrações de AH não diferiram entre os tempos de estocagem (p=0,18). As concentrações do TIMP-1 se correlacionaram negativamente com o tempo de estocagem (r=-0,65; p<0,0001), enquanto que as de AH não (r=-0,15; p=0,41). Defeitos reparados com MAs estocadas a curto prazo se epitelizaram mais cedo que aqueles reparados com MAs estocadas a médio (p<0,01) e longo prazo (p=0,02). Ademais, observou-se correlação entre a concentração de TIMP-1 e a epitelização corneal (r=0,62; p=0,002). A opacidade corneal foi considerada moderada em 55% dos casos. Todavia, observou-se correlação negativa entre opacidade corneal e a concetração de AH nas MAs (r=-0,47; p=0,03). Boa visão foi observada em mais pacientes com úlceras profundas e descemetoceles que em olhos com perfuração (p=0,004). Diante dos resultados, conclui-se que a concentração da TIMP-1 de MAs caninas diminuem significativamente em um ano, enquanto que as de AH não se alteram. Defeitos corneais complicados reparados com MA criopreservadas por curto prazo cicatrizam mais cedo e tendem a serem mais transparentes, porém, resultados variando de satisfatório a ótimo são obtidos em olhos reparados com MAs preservadas a médio e longo prazo.
Aspectos clínicos e imunológicos em cães com leishmaniose visceral tratados com miltefosina e/ou alopurinol
No Brasil, o tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC) com miltefosina (MilteforanTM, Virbac) foi autorizado em 2016 e o medicamento lançado no mercado brasileiro em janeiro de 2017. Os relatórios sobre a condição clínica, clínico-patológica e imunológica de cães tratados no país são escassos. Assim, este ensaio clínico terapêutico avaliou e monitorou, a curto prazo, a eficácia de três protocolos farmacoterapêuticos: monoterapia de miltefosina (G1), miltefosina associada ao alopurinol (G2) e monoterapia de alopurinol (G3) em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum. Quarenta e cinco cães com LVC foram designados igualmente para um dos três grupos de tratamento e examinados antes (D0) e depois (D29) da
intervenção medicamentosa. O artigo 1 foi desenvolvido com todos os grupos, enquanto o artigo 2 foi escrito com dois grupos G1 e G2. Os cães foram avaliados quanto aos sinais clínicos, hematológicos, bioquímicos, concentração sérica de anticorpos e de citocinas e biomarcadores urinários. Redução significativa (p<0,05) nos escores clínicos foi observada em todos os protocolos avaliados, sem diferença entre os grupos. Não observamos cura clínica em nenhum dos cães dos grupos. Os parâmetros hematológicos e bioquímicos apresentaram melhora em D29, com melhores resultados observados no G2. O título de anticorpos anti-Leishmania permaneceu elevado em todos os grupos. A quantificação de citocinas séricas, demonstrou perfil Th1/Th2 misto na LVC. Os níveis de IL-2 diminuíram em todos os grupos após o tratamento, porém não apresentaram diferença estatística. A avaliação de IFN-y e IL-10 não evidenciou alterações nos grupos analisados e não contribuiu para o acompanhamento terapêutico de curto prazo. Proteinúria e densidade urinária não diminuíram significativamente após os tratamentos. Com relação aos biomarcadores renais, a Cistatina C e microalbuminúria não apresentaram alterações significativas. Já a NGAL apresentou redução significativa no grupo G2 (p < 0,05). Todos os protocolos terapêuticos promoveram, em graus variados, melhora no quadro geral (sinal clínico, hematológico e bioquímico) dos cães. No entanto, a associação
de miltefosina e alopurinol (G2) promoveu melhores efeitos clínico-patológicos, representando a melhor opção para o tratamento da LVC, inclusive quando comparado ao único protocolo terapêutico permitido no Brasil, monoterapia com miltefosina (G1). A IL-2 apresentou comportamento similar nos grupos após os tratamentos, sugerindo que a diminuição dessa citocina possa estar associada ao controle terapêutico da infecção, além de serem potenciais marcadores terapêuticos para o monitoramento e acompanhamento de cães com LVC. Estes medicamentos se mostraram seguros para a função renal durante o período de acompanhamento, promovendo melhora nos biomarcadores urinários analisados.
Isolamento e genotipagem de toxoplasma gondii de animais domésticos, animais silvestres e humanos do estado de Mato Grosso, Brasil
Os estudos envolvendo a variabilidade genética de Toxoplasma gondii são importantes, pois podem sugerir diferenças na patogenicidade de cada cepa e auxiliar no conhecimento da epidemiologia da infecção. Assim, o presente trabalho teve como objetivo isolar T. gondii por meio do bioensaio em camundongo e descrever a diversidade genética de cepas isoladas de animais domésticos, animais silvestres e humanos no estado de Mato Grosso. Para isso, fragmentos de amostras de tecidos (coração, cérebro e pulmão) de 04 gatos, 35 cães, 115 animais silvestres, e líquido amniótico de 08 mulheres gestantes, além de amostras de tecidos (coração e cérebro) de 153 galinhas de criação livre foram coletados de agosto de 2017 a dezembro de
2019 e submetidos ao bioensaio em camundongos. No total, foram obtidos 01 isolado de gato, 09 de cães, 10 de animais silvestres e 02 de mulheres de cinco municípios do Estado do Mato Grosso, além de 51 isolados de galinhas de seis municípios do mesmo Estado, os quais foram submetidos ao processo de extração de DNA. As amostras de DNA extraídos foram provenientes dos pulmões e/ou cérebros de camundongos infectados e de “amostras primárias” (alíquotas de homogeneizados de tecidos de animais silvestres e fluidos amnióticos de mulheres gestantes que não obtiveram sucesso no isolamento) com o kit comercial DNeasy® Blood & Tissue®. O DNA foi submetido à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) visando a amplificação de um fragmento de DNA repetitivo de 529 pares de bases do genoma de T. gondii. Todas as amostras positivas na PCR foram genotipadas pela técnica de análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) com 11 marcadores [SAG1, SAG2 (5’3′SAG2 e alt. SAG2), SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3]. Relatamos pela primeira vez isolados de T. gondii por meio do bioensaio em Crax fasciolata (Mutum de Penacho), Dasyprocta azarae (Cutia) e Leopardus pardalis (Jaguatirica). Além disso, a PCR-RFLP de todas as amostras analisadas revelaram 21 genótipos de T. gondii, sendo 14 descritos anteriormente, incluindo #2 tipo III (n = 1), #6 tipo BrI (n = 5), #8 tipo BrIII (n = 12), #11 (n = 3), #14 (n = 3), #19 (n = 1), #41 (n = 2), #99 (n = 1), #108 (n = 1), #109 (n = 4), #116 (n = 1), #140 (n= 4), #166 (n = 13), #190 (n = 2), e sete novos genótipos, além de seis isolados com infecção mista. Os dados são apresentados em separado por artigo no tópico resultados. Destacamos a presença de infecção pelo mesmo genótipo (#14 e #166) em humanos, cães domésticos, galinhas de criação livre e animais silvestres sugerindo fonte de infecção comum no ciclo biológico. Esses resultados confirmam a alta diversidade de cepas de T. gondii em Mato Grosso, sugerindo uma importância aos genótipos #166 e #8 para a região, pois foram os mais observados nas amostras analisadas.
Uso de andrógenos e treino resistido em camundongos com osteoporose
A osteoporose é a doença osteometabólica mais comum em humanos e animais, e ocasiona a perda da massa óssea. Tal enfermidade afeta mais de 15% dos humanos acima de 40 anos. No período do ano de 2001 a 2011 houve aumento na prevalência de 55% na população acima de 60 anos. Também é estimado que no ano de 2050 o Brasil terá maior número de população de idosos comparado a crianças e adultos. O presente estudo tem como finalidade avaliar o efeito da terapia medicamentosa dos seguintes fármacos: estanozolol 5mg/kg/semana, injetado pela via subcutânea durante nove semanas e o decanoato de nandrolona 3mg/kg/semana injetado pela via subcutânea durante nove semanas. Ambos os grupos realizaram treinamento resistido de escalada em escada vertical. Foi realizado um modelo experimental de osteoporose cirurgicamente induzida em camundongos fêmeas, da linhagem Swiss, com 16 semanas de idade. A doença osteometabólica foi induzida pela ovariectomia bilateral, sendo que, após o procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos durante nove semanas em repouso, após este período iniciou-se o tratamento que durou nove semanas. No transcorrer do tratamento foi realizado o controle do peso corpóreo vivo, controle de consumo diário de ração. Após ao período de tratamento os animais foram submetidos a eutanásia, foram realizadas análises histomorfométricas dos músculos gastrocnêmio e sóleo. Mediante ao resultado das analises histomorfométricas os andrógenos (decanoato de nandrolona e estanozolol) produziram hipertrofia nos músculos gastrocnêmio e sóleo em camundongos da linhagem Swiss. Acredita-se com isso que esses animais tenham melhores condições de suportar ossos osteoporóticos, no entanto, são necessários outros estudos complementares para confirmação dessa hipótese.
Epidemiologia das Leishmanioses e Fauna de Flebotomíneos no Pantanal de Mato Grosso
As leishmanioses formam um grupo de doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitida por flebotomíneos. Os objetivos: 1) avaliar a situação epidemiológica das leishmanioses nos municípios abrangentes do Pantanal de Mato Grosso; 2) verificar a fauna flebotomínea, bem como estabelecer a distribuição, riqueza e abundância das espécies em um município do Pantanal de Mato Grosso. Os dados epidemiológicos com respeito aos casos humanos, caninos e vetoriais foram coletados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) e do Departamento de Vigilância Ambiental da Secretaria de Estado de Saúde, respectivamente; correspondendo ao período de 2007 a 2016. Estudo de campo e laboratório: os insetos foram coletados com armadilhas de luz (CDC), instaladas em dez residências na área urbana do município de Barão de Melgaço, no período de 2015 a 2017. Entre 2007 e 2016, dez casos humanos de leishmaniose visceral (LV) e 499 casos da forma cutânea (LT) foram identificados na região do Pantanal, com seis dos sete municípios apresentando circulação do parasito em cães (variadas prevalências) e presença de vetores LV em cinco municípios e de LT em seis deles. O monitoramento de 2015 a 2017 resultou em 6.013 flebotomíneos distribuídos em dois gêneros e 26 espécies, com predomínio de Brumptomyia brumpti, seguido por Lutzomyia evandroi e Lu. walkeri, juntos representaram 81,4% dos indivíduos coletados. Lutzomyia cruzi (vetor de LV), Lu. antunesi, Lu. flaviscutellata e Lu. whitmani (vetores de LT) foram coletados em algumas residências em baixa densidade. Embora a região do Pantanal não tenha apresentado números expressivos de casos de leishmanioses entre os anos de 2007 e 2016, aliado ao fato do município de Barão de Melgaço apresentar baixa densidade de espécies transmissoras do agravo em questão, o fortalecimento dos serviços de vigilância é fundamental para evitar um crescimento na população vetorial com consequente aumento de casos caninos e humanos.
Diversidade de carrapatos e pesquisa de agentes infecciosos transmitidos por artrópodes em pequenos mamíferos silvestres do estado de Mato Grosso, Brasil
Os pequenos mamíferos e seus ectoparasitas participam da cadeia de transmissão de diferentes patógenos, podendo exercer papel de reservatórios e vetores agentes patogênicos que causam doenças. Neste contexto, carrapatos e amostras de tecidos (sangue, baço, fígado e pulmão) de pequenos mamíferos de onze diferentes municípios do Estado de Mato Grosso, Brasil, foram submetidos à extração de DNA e, posteriormente, à Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) com objetivo de amplificar um fragmento de DNA de bactérias do gênero Bartonella spp. e Coxiella burnetii, protozoários dos gêneros Hepatozoon e Ordem Piroplasmorida (gêneros Babesia e Theileria). Além disso, os carrapatos coletados de pequenos mamíferos terrestres foram submetidos a detecção molecular de Rickettsia spp. No total, 5,7, 5,34 e 0,63% das amostras foram positivas para Bartonella spp., Babesia spp. e
Hepatozoon spp., respectivamente, em pequenos mamíferos. O total de 72 carrapatos foi identificado e DNA de Rickettsia amblyommatis e Rickettsia belliii foram detectados em Amblyomma auricularium. Relatamos pela primeira vez em Mato Grosso: i. Bartonella spp. em morcegos Lophostoma silvicolum, Myotis nigricans, Phyllostomus elongatus e Pteronotus rubiginosus, além de um possível novo genótipo de Bartonella spp. em L. silvicolum; ii. Neacomys amoenus infectados com Hepatozoon sp.; iii. diferente morfotipo de Ornithodoros guaporensis; iv. ocorrência de argasídeo O. guaporensis no bioma Cerrado; v. ninfas de Amblyomma cajennense sensu stricto e A. auricularium parasitando roedores Thrichomys pachyurus. Portanto, importantes patógenos circulam em pequenos mamíferos silvestres no Estado de Mato Grosso e também nos carrapatos, sendo algumas espécies descritas pela primeira vez como hospedeiras por meio desse estudo.
Murine models for human bone disease
A osteoporose é uma doença metabólica que acomete os ossos promovendo fragilidade. É um problema mundial de saúde que afeta uma em cada três mulheres e um em cada cinco homens. Os Bifosfonatos são o grupo farmacológico mais utilizado no tratamento desta doença, mas após um longo período de utilização sua ação é revertida, deixando os ossos susceptíveis a fratura. Desta forma faz se necessário pesquisas que elucidem a fragilidade óssea devido a osteoporose bem como após longos tempo de tratamento. Sendo assim, objetivamos desenvolver novas estratégias para estudar ossos osteoporóticos através de modelos de osteoporose em camundongos e ratos, sendo uma nova técnica para avaliar a qualidade óssea em escala nanométrica in vivo, estratégias para realizar análises biomecânicas, um modelo de osteopenia e um modelo experimental de camundongos para estudar o efeito deletério do Bifosfonato a longo prazo. Foram realizados quatro estudos. Primeiro, o osso osteoporótico foi avaliado através da Espectroscopia Raman in vivo aonde os camundongos controle (N = 7) foram comparados com os ovariectomizados (n = 7) para avaliação da qualidade óssea. Segundo, para avaliar a fragilidade óssea através de parâmetros biomecânicos em modelos de osteoporose induzida em roedores utilizou-se um grupo de camundongos controle (n = 7) e outro ovariectomizados (n = 7); e um grupo de ratos controle (n = 5) e ovariectomizados (n = 6) que tiveram os fêmures dissecados após eutanásia para que o colo do fêmur recebesse um teste de carga até a deformação permanente, de maneira fisiológica, restrita ou irrestrita. E a influência do ganho de peso nos resultados foi discutida através de duas maneiras de normalizar os mesmo. Terceiro, foi realizado um modelo de osteopenia por desuso para avaliar como os compartimento da tíbia (cortical, trabécula e geometria) se comportam após 5 (n = 5), 35 (n = 4), 65 (n = 5) e 95 (n = 3) dias de desuso por neurectomia do ciático. Por último, buscando o efeito deletério do Bifosfonato três grupos camundongos foram formados: controle (n = 7), ovariectomizados (n = 7) e ovariectomizados seguida da administração de Ibandronato. Após eutanásia os fêmures foram coletados para testes biomecânicos no colo femoral a as tíbias foram utilizadas para análise de arquitetura, massa e geometria. Conclusões: Primeira, a espectroscopia Raman mostrou uma diminuição na qualidade óssea dos animais osteoporóticos através da diminuição da quantidade de cálcio, glicosaminoglicanos e aumento do conteudo de lipídios. Segunda, é possível realizar testes de carga em fêmures de camundongos e ratos de maneira
fisiológica para encontrar a fragilidade promovida pela osteoporose, porem isto depende da sensibilidade do teste (restrita e irrestrita) e é necessária uma normalização dos resultados através da massa corporal. Terceira, os ossos osteopenicos reabsorveram cada compartimento de uma maneira diferente, aonde a trabécula se deteriora primeiro, mas exige mais tempo para atingir um platô do que a cortical. E por último, a ovariectomia combinada com Bifosfonato a longo prazo em camundongos promove um padrão diferente de fratura no colo do fêmur e um efeito deletério na geometria da tíbia.
“Draft” genoma e análise filogenética do Trypanosoma caninum
Descrito na última década, infectando cães em diversas regiões brasileiras, aspectos biológicos e epidemiológicos da infecção por Trypanosoma caninum ainda são desconhecidos. Devido aos avanços das técnicas de Sequenciamento de Nova Geração (SNG), o estudo sobre a biologia evolutiva dos tripanosomatídeos teve um acréscimo substancial de informações genéticas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi apresentar informações sobre o genoma desta espécie e realizar a comparação gênica com outros tripanosomatídeos, utilizando a plataforma Miseq para o sequenciamento parcial do genoma. Filogeneticamente, T. caninum demonstrou proximidade com T. cruzi e T. rangeli. A adaptação deste parasito ao cão doméstico e uma provável redução do seu genoma podem estar elencados ao seu processo evolutivo. Ademais, o sequenciamento do genoma também possibilitou a investigação de genes/proteínas alvos para o seu diagnóstico específico. Assim, os oligonucleotídeos sintéticos 5’-AGCCAATAGCAAGGGTGGAA-3’ e 5’-GCGTCATCCATTTTCGAGGC-3’ foram desenhados baseados na região 18S do rDNA de T. caninum que amplificam um produto de 248 pb. Estes oligonucleotideos
mostraram-se específicos e sensíveis para T. caninum, já que o limite mínimo de detecção foi de 10 cópias de DNA do parasito.
Análise clínico-patológica e soroepidemiológica pelo uso de peptídeos sintéticos de proteínas trp de Ehrlichia canis e Ehrlichia chaffeensis no Brasil
Erliquias são bactérias Gram negativas classificadas na ordem Rickettsiales e família Anaplasmataceae. Dentre as seis espécies descritas, destacamos Ehrlichia canis que é o agente etiológico da Erliquiose Monocítica Canina (EMC), uma doença grave e endêmica no Brasil, e E. chaffeensis que é o agente etiológico da Erliquiose Monocítica Humana (EMH), uma zoonose emergente difundida na América do Norte. A partir de avanços no campo da biologia molecular um grupo de proteínas que apresentam sequências de repetições de aminoácidos (tandem repeat protein-TRP) foram identificadas e caracterizadas. As proteínas TRP19 e TRP32 apresentaram-se conservadas entre diferentes isolados de E. canis e E. chaffeensis respectivamente. Contudo, a TRP36 de E. canis demonstrou divergência entre isolados, tornando-a excelente alvo para identificar diferentes genótipos da bactéria. Essas proteínas são importantes e excelentes para o diagnóstico das erliquioses. O presente estudo objetivou avaliar a aplicabilidade das TRPs no diagnóstico da EMC em população canina suspeita em área endêmica, verificar se existem diferenças clínicas e hematológicas em cães infectados pelos diferentes genótipos, determinar a distribuição dos diferentes genótipos de E. canis no Brasil e investigar cães sororreagentes ao antígeno de E. chaffeensis. A TRP19 mostrou ser excelente ferramenta para o diagnóstico sorológico de EMC em área endêmica para erliquiose canina. Não observamos diferenças clínicas em cães infectados pelos genótipos distintos de E. canis. TRP19 apresentou correlação positiva com a variável proteína e correlação negativa com hematócrito e plaquetas. USTRP36 mostrou forte correlação positiva com proteínas. Ainda, o diagnóstico baseado em TRP19 mostrou associação com anemia, trombocitopenia e hiperproteinemia. De modo geral, os genótipos americano e brasileiro de E. canis estão amplamente distribuídos pelo Brasil, com exceção da região Sul do Brasil onde a soro-ocorrência é baixa. Reação sorológica frente ao genótipo da TRP36 “Costa Rica” e à proteína TRP32, específica de E. chaffeensis,foi observado pela primeira vez no Brasil.
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